fa طراحی و ساخت سازه‌های پلاسمیدی مختص انتقال هدفمند ژن به ژنوم کلروپلاستی تخصصي Special پژوهشي Scientific & Research الحاق ژن خارجی در ژنوم کلروپلاستی از طریق نوترکیبی همتا بین توالی‌های مجاور آن ژن در حامل‌های کلروپلاستی، رخ می‌دهد. از آنجایی که شباهت صد در صدی توالی هدف‌گیری‌کننده کارایی تراریختی پلاستوم را به طور چشمگیری افزایش خواهد داد، یک جفت پرایمر برای جداسازی این ناحیه طوری طراحی گردید که دارای شباهت صد در صدی در تمامی پلاستوم‌های گیاهی باشد، ولی طول و توالی ناحیه تکثیری در ژنوم‌های مختلف متفاوت بود. توالی هدف‌گیری کننده، از پلاستوم‌های توتون، پنبه، ذرت، کاهو، گوجه‌فرنگی، هویج و حتی کلزا و لیموترش که پلاستوم آنها هنوز توالی‌یابی نشده است، جداسازی و کلون‌سازی گردید. حضور و جهت ناحیه جداشده از پلاستوم گیاهان مختلف و صحت کلون‌سازی، توسط آنزیم‌های مختلف و از جمله HindIII و BamHI مورد تایید قرار گرفت. سپس با افزودن نواحی تنظیمی مختلف شامل پیشبرها و پایانبرهای دائمی کلروپلاستی و القایی، نواحی بدون ترجمه یا UTRهای مناسب، نواحی اتصال ریبوزوم پلاستیدی، جایگاه‌های آنزیمی مناسبِ ورود ژن برای بیان انفرادی و یا پلی‌سیسترونی، ژن‌های گزارشگر، ژن‌های نشانگر انتخابی آنتی‌بیوتیکی و غیرآنتی‌بیوتیکی و توالی‌هایی برای حذف ژن نشانگر پس از انتقال ژن، تلاش شد تا انواع مختلفی از حامل‌های کلروپلاستی ساخته شوند تا بتوان بیان هر ژن خارجی را به طور دلخواه در ژنوم‌های پلاستیدی گیاهان مختلف به صورت کارآمد امکان‌پذیر نمود که سازه‌های کلروپلاستی pFNGi، pFNG از جمله آنها بود. این پلاسمیدهای نوترکیب می‌توانند به عنوان حامل‌های پلاستیدی عمومی و اختصاصی برای انتقال ژن به کلروپلاست استفاده شوند. در این تحقیق نه تنها برای گیاهان مذکور، بلکه برای هر گونه گیاهی دیگری که توالی پلاستومی آن در دسترس نیست نیز حامل پلاستیدی اختصاصی و دارای کارایی بالا تهیه شد. Integration of foreign genes into plastid genomes occur through homologous recombination between flanking sequences of gene in plastid vectors. In this study, by analysis of plastid genomes using bioinformatics databases, we succeed to select a region of plastome as alien gene targeting sequence including the appropriate length for homologous recombination and integration in plastome, specific plastid origin of replication, targeting gene to inverted repeat region of plastid genome and unique restriction enzymes recognition sites in the center of flanking region sequences for alien gene integration. Since similarity (%) of the flanking region sequences would increase transformation efficiency of plastome dramatically, therefore, a pair of primers was designed to isolate the plastome flanking regions. These primers were100% similar to all plant plastomes, but the length and sequence of their amplified fragments were variable in different plant plastomes. Flanking region sequence from tobacco, cotton, corn, lettuce, tomato, carrot, and even the canola and lemon plastomes that still their plastome sequences are not available in Gene Bank were isolated and cloned. The accuracy of cloning, present and direction of flanking regions fragment from different plant plastomes were confirmed by enzymatic digestion analysis using HindIII and BamHI. Then different types of chloroplastid vectors using different regulation elements were constructed. The regulation elements that could be used for efficient expression of any alien genes in different plastids were including plastid constitutive or inducing promoters and terminators, suitable untraslated regions, Ribosome binding sites of plastid, suitable restriction enzyme recognition sites for cloning and expression of desired gene in single or polycistronic status, reporter genes, antibiotic or non-antibiotic markers and sequences for removing of marker gene. These recombinant chloroplast plasmids including pFNGi and pFNG can be used as universal and specific vectors for chloroplast transformation. Thus, in this study we succeeded to design the high efficient and specific plastid vectors, not only for plants which their plastomes were completely sequenced, but also for other plant species that there is not any sequence of their plastomes availaable in databanks. : پلاستوم, تراریزش و حامل اختصاصی کلروپلاستی Plastome, Specific chloroplastic vectors and Transformation. 218 234 http://agrobreedjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1-62&slc_lang=fa&sid=1 Motahhareh Mohsenpour مطهره محسن‌پور mthrhm@yahoo.com 100319475328460011294 100319475328460011294 Yes ، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی Masoud Tohidfar مسعود توحیدفر 100319475328460011295 100319475328460011295 No ، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی Nadali Babaian-Jelodar نادعلی بابائیان جلودار 100319475328460011296 100319475328460011296 No دانشکاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری